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通过CRISPR/Cas9技术得到敲除铁调素基因斑马鱼的制备方法
审中-实审

申请号:201510582860.5 申请日:2015-09-14
摘要:本发明主要涉及利用CRISPR/Cas9技术,设计独特的一段PAM区,使得斑马鱼中的铁调素基因被敲除,又不“误伤”其他基因,形成调素敲除的斑马鱼。作为首例铁调素敲除转基因的模式动物斑马鱼的意义重大,铁调素是调控铁的主要因素,一旦被敲除,即成功动物模成铁过载的模式动物,可以排除人为因素干预,对于研究铁的表达研究意义重大,同时与传统敲除基因的技术相比,CRISPR/Cas9技术具有毒性小,准确性高,效率高,成功周期短等特点;使得铁调素基因更快得被敲除。
申请人: 徐又佳
地址: 215004 江苏省苏州市三香路1055号
发明(设计)人: 姜宇 仲兆民 朱国兴 牛鹏飞 杨健 易利华 陈斌 徐又佳
主分类号: C12N15/89(2006.01)I
分类号: C12N15/89(2006.01)I C12N15/11(2006.01)I C12N15/10(2006.01)I A01K67/027(2006.01)I
  • 法律状态
2016-02-24  实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/89申请日:20150914
2016-01-27  公开
注:本法律状态信息仅供参考,即时准确的法律状态信息须到国家知识产权局办理专利登记簿副本。
  • 其他信息
主权项  通过CRISPR/Cas9技术得到敲除铁调素基因斑马鱼的制备方法,其特征在于,其包括如下步骤:(1)在铁调素基因第一个外显子和内含子之间设计gRNA序列,gRNA序列为CCAAGCGCCAAGTCACCTTTCC;(2)设计并合成gRNA引物,引物序列为P3:Forward?sequence(5’to3’):TAACGTGTTTCTGGCTGCTG,P4:Reverse?sequence(5’to3’):AAAAGCACCGACTCGGTGCC;(3)以上述的引物、gRNA?plasmid为模板进行PCR反应,PCR反应条件为:95℃预变性3min,进入三步循环:95℃?20s、58℃?20s、72℃?20s共30个循环,然后72℃?10min,最后保温在16℃;电泳检测PCR产物后,进行纯化;(4)RNA?Free条件下,将上述的PCR产物进行体外转录得到gRNA,转录体系中加入T7聚合酶和NTP,37℃,1hour反应完毕,然后进行纯化;(5)将前述纯化后的gRNA和Cas9蛋白显微注射到单细胞的斑马鱼胚胎中,24小时后提取DNA进行测序检测;(6)3?4个月后斑马鱼性成熟后,将突变的斑马鱼与野生型的斑马鱼杂交,得到一定概率的杂合子,将胚胎进行RNA提取并逆转录成DNA送测序查看是否有突变,这时候的DNA还是双链的;(7)将测序后发现突变的斑马鱼的cDNA和19T载体相连接后,将其在培养基中滚珠图板,经过12?14小时后,已经连接的质粒会以斑点形式成长,将其挑斑后,这时候得到的是单链的DNA,再次送测序,最终得到单链的突变,这时候为真正杂合的突变体,然后将其培养长大;(8)经过3?4个月后性成熟后,第二代的突变成年的雄鱼与雌鱼再次切除尾巴,进行鉴定,突变的斑马鱼再次交配,从而得到纯合的铁调素敲除的斑马鱼。
公开号  105274144A
公开日  2016-01-27
专利代理机构  苏州创元专利商标事务所有限公司 32103
代理人  范晴
颁证日  
优先权  
国际申请  
国际公布  
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