一种PCV2病毒样颗粒及其制备方法和裂解及VLP组装缓冲液
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PCV2 virus-like particles as well as preparation method thereof and splitting and VLP assembly buffer liquor
申请号：201410145870.8 申请日：2014-04-11
CN201410145870
CN104073473A
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摘要：本发明公开了一种PCV2病毒样颗粒及其制备方法和裂解及VLP组装缓冲液。基于自主优化设计，并人工合成适合在原核表达系统中高效表达的PCV2核衣壳蛋白基因，通过大肠杆菌原核表达系统表达PCV2核衣壳蛋白的全长基因序列，并利用其可溶性核衣壳蛋白在特定条件下高效自体组装成了病毒样颗粒。本发明创新点主要在于采用不同于常规的真核表达系统获取VLPs方法，而是利用原核表达系统获取PCV2VLPs，本方法成本低廉、简单高效，适合大规模产业化应用；其中还应用到独创的既可以促进菌体裂解又能适合VLPs自体组装的双功能于一体的缓冲液配方；另外发明所获得的PCV2病毒样颗粒与野生型病毒外形相似度高，并且免疫原性好，可以用于研发具有应用潜力的猪圆环病毒的亚单位疫苗及药物传递载体。 |
|---|---|
| Abstract： The invention discloses PCV2 virus-like particles as well as a preparation method thereof and splitting and VLP assembly buffer liquor. Based on an autonomous optimization design, a PCV2 nucleocapsid protein gene which is suitable for efficiently expressing in a prokaryotic expression system is artificially synthesized, a full-length gene sequence of the PCV2 nucleocapsid protein gene is expressed by an escherichia coli prokaryotic expression system, and the virus-like particles are efficiently and autonomously assembled by utilizing soluble nucleocapsid protein of the full-length gene sequence under a special condition. An innovation point of the invention is that PCV2VLPs are obtained by utilizing the prokaryotic expression system instead of adopting the conventional method for obtaining VLPs through an eukaryotic expression system; the method is low in cost, simple and efficient, and suitable for large-scale industrial application; moreover, an innovative buffer liquor formula integrating double functions, which not only can promote thallus splitting, but also can be suitable for self-assembling of VLPs, is also applied; besides, the PCV2 virus-like particles obtained in the invention are very highly similar with wild type virus in outline and good in immunogenicity, and can be applied to developing a subunit vaccine and a drug delivery carrier with utilization potentiality of porcine circovirus. | |
| 申请人： 美国普赛生物高科技有限责任公司 湖南农业大学 | |
| 当前权利人： 湖南派智生物科技有限公司 | |
| Applicant： AMERICAN PERCE BIOLOG HIGH TECH LTD; UNIV HUNAN AGRICULTURAL | |
| 地址： 美国马里兰州罗克维********(隐藏) | |
| 发明(设计)人： 杨毅 雷昕诺 王乃东 邓治邦 湛阳 王爱兵 薛立群 张颜 | |
| Inventor： YANG YI; LEI XINNUO; WANG NAIDONG; DENG ZHIBANG; ZHAN YANG; WANG AIBING; XUE LIQUN; ZHANG YAN | |
| 主分类号： C12N7/04(2006.01)I | |
| 分类号： C12N7/04(2006.01)I C12N15/70(2006.01)I C12N15/34(2006.01)I C12R1/93(2006.01)N | |
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- 法律状态
| 2022-05-06 | 专利权的转移IPC(主分类):C12N7/04登记生效日:20220425变更前专利权人:美国普赛生物高科技有限责任公司变更前地址:美国马里兰州罗克维尔市,12111,帕克路,生物医学研究所,普赛有限责任公司变更前专利权人:湖南农业大学变更后专利权人:湖南派智生物科技有限公司变更后地址:410128 湖南省长沙市芙蓉区东湖街道办事处78号院02房 |
| 2016-03-23 | 授权 |
| 2014-10-29 | 实质审查的生效 IPC(主分类):C12N 7/04 申请日:20140411 |
| 2014-10-01 | 公开 |
注：本法律状态信息仅供参考，即时准确的法律状态信息须到国家知识产权局办理专利登记簿副本。
- 其他信息
| 主权项 | 一种PCV2病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，依次包括以下步骤：1）选取利用密码子的兼并性，人工合成的适合于原核表达的编码PCV2核衣壳蛋白全长基因；2）将基因序列与表达质粒载体重组得到的重组质粒转化大肠杆菌，然后加入IPTG，使得体系中其浓度为0.1?1mM，并在25?37℃进行诱导表达；3）将诱导表达PCV2核衣壳蛋白时获取的细菌沉淀用以下配方的裂解及VLP组装缓冲液重悬，超声处理，离心收集上清，树脂吸附目的蛋白，然后从树脂上洗脱目的蛋白；所述的裂解及VLP组装缓冲液配方为：0.1M?NaH2PO4·2H2O、0.1M?Na2HPO4、20mM?Imidazole、10mM?Tris?base、300mM?NaCl、50mM?KCl、2mM?MgCl2、0.1M?Ammonium?citrate、2%Glycerine、0.5%Triton?X?100、5mMβ?Me、0.1mM?PMSF、1U/mL?Leupeptin?Protease?inhibitor；其中Triton?X?100、β?Me、PMSF、Leupeptin?Protease?inhibitor现用现加，缓冲液pH8.0，余量为纯水。 | ||||||||||||||||||
| 公开号 | 104073473A | ||||||||||||||||||
| 公开日 | 2014-10-01 | ||||||||||||||||||
| 专利代理机构 | 长沙市融智专利事务所 43114 | ||||||||||||||||||
| 代理人 | 袁靖 | ||||||||||||||||||
| 颁证日 | |||||||||||||||||||
| 优先权 |
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| 国际申请 | |||||||||||||||||||
| 国际公布 | |||||||||||||||||||
| 进入国家日期 | |||||||||||||||||||
- 专利对比文献
| 类型 | 阶段 | 文献号 | 公开日期 | 涉及权利要求项 | 相关页数 |
| A | SEA | CN103451196A | 20131218 | 1-10 | 全文 |
注：不保证该信息的有效性、完整性、准确性，以上信息也不具有任何效力，仅供参考。使用前请另行委托专业机构进一步查核，使用该信息的一切后果由用户自行负责。
Ｘ：单独影响权利要求的新颖性或创造性的文件；
Ｙ：与检索报告中其他 Ｙ类文件组合后影响权利要求的创造性的文件；
Ａ：背景技术文件，即反映权利要求的部分技术特征或者有关的现有技术的文件；
Ｒ：任何单位或个人在申请日向专利局提交的、属于同样的发明创造的专利或专利申请文件；
Ｐ：中间文件，其公开日在申请的申请日与所要求的优先权日之间的文件，或会导致需核实该申请优先权的文件；
Ｅ：单独影响权利要求新颖性的抵触申请文件。
Ｙ：与检索报告中其他 Ｙ类文件组合后影响权利要求的创造性的文件；
Ａ：背景技术文件，即反映权利要求的部分技术特征或者有关的现有技术的文件；
Ｒ：任何单位或个人在申请日向专利局提交的、属于同样的发明创造的专利或专利申请文件；
Ｐ：中间文件，其公开日在申请的申请日与所要求的优先权日之间的文件，或会导致需核实该申请优先权的文件；
Ｅ：单独影响权利要求新颖性的抵触申请文件。
- 期刊对比文献
| 类型 | 阶段 | 期刊文摘名称 | 作者 | 标题 | 涉及权利要求项 | 相关页数 |
| A | SEA | 《Journal of Virological Methods》20090805162doi:10.1016/j.jviromet.2009.07.028 | Zuzana Marcekova等 | Heterologous expression of full-length capsid protein of porcine circovirus 2 in Escherichia coli and its potential use for detection of antibodies | 1-10 | 第133–141页 |
| ZUZANA MARCEKOVA等: "Heterologous expression of full-length capsid protein of porcine circovirus 2 in Escherichia coli and its potential use for detection of antibodies", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 | ||||||
| A | SEA | 《Virology Journal》201007217166 | Shuanghui Yin等 | Self-assembly of virus-like particles of porcine circovirus type 2 capsid protein expressed from Escherichia coli | 1-10 | 第1-5页 |
| SHUANGHUI YIN等: "Self-assembly of virus-like particles of porcine circovirus type 2 capsid protein expressed from Escherichia coli", 《VIROLOGY JOURNAL》 | ||||||
| A | SEA | 《Appl Microbiol Biotechnol》2012041295doi:10.1007/s00253-012-4015-2 | Pei-Ching Wu等 | Characterization of porcine circovirus type 2 (PCV2) capsid particle assembly and its application to virus-like particle vaccine development | 1-10 | 第1501–1507页 |
| PEI-CHING WU等: "Characterization of porcine circovirus type 2 (PCV2) capsid particle assembly and its application to virus-like particle vaccine development", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》 | ||||||
- 书籍对比文献
| 类型 | 阶段 | 书名 | 作者 | 标题 | 涉及权利要求项 | 相关页数 |
