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一种基于时间分辨荧光法和DNA杂交的大肠埃希氏菌检测方法
无权-视为撤回

申请号:200910308402.7 申请日:2009-10-16
摘要:本发明公开了一种基于时间分辨荧光法和DNA杂交的大肠埃希氏菌检测方法。根据大肠埃希氏菌DNA目标序列设计了捕获探针DNA1和识别探针DNA2,捕获探针DNA1固定标记在玻璃片上;识别探针DNA2联接长寿命发光稀土铕配合物。当DNA1与DNA2串联时能够与目标DNA(即待测生物的DNA)发生碱基互补的杂交反应;构建了基于普通玻片表面两探针串联的DNA检测模型。将长寿命发光的稀土铕配合物作为识别探针DNA2的标记物,利用时间分辨荧光的方法能有效消除生物体系内源荧光和固体基质背景光的干扰。本发明检测方法用时短,反应结果直观、灵敏、准确,具有十分显著的优点。
申请人: 湖南大学
地址: 410082湖南省长沙市麓山南路2号
发明(设计)人: 阮敏 牛承岗 王晓钰 秦品珠 曾光明 何慧 黄兢
主分类号: C12Q1/68(2006.01)I
分类号: C12Q1/68(2006.01)I G01N21/64(2006.01)I C12R1/19(2006.01)N
  • 法律状态
2012-08-08  发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C12Q 1/68公开日:20100310
2010-04-28  实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20091016
2010-03-10  公开
注:本法律状态信息仅供参考,即时准确的法律状态信息须到国家知识产权局办理专利登记簿副本。
  • 其他信息
主权项  1.一种基于时间分辨荧光法和DNA杂交的大肠埃希氏菌检测方法,其 特征在于, A、捕获探针DNA1的固定 先将玻片醛基化,再将碱基序列为5’-ACA TTG ACG CAG GTG ATC GGA CG TTTTTTTTTT-3’-NH2的捕获探针DNA1配成使用浓度5μg/mL,取40μLDNA1滴加到己醛基化的 玻片表面,室温反应3h;最后洗涤并封闭剩余的醛基; B、稀土铕配合物标记识别探针DNA2 (1)将2mg稀土铕配合物Eu(TTA)3(NH2-phen)分散到5mL 2.5%戊二醛溶液中,室温下剧 烈震荡5h,离心后用二次蒸馏水洗3次,得到醛基修饰的Eu(TTA)3phen颗粒重新悬于4mL pH 为7.2的PBS缓冲液中; (2)再将碱基序列为NH2-5’-TTTTTTTTTT GTA TCG GTG TGA GCG TCG CAG AA-3’的识 别探针DNA2配成使用浓度15μg/mL,加入到稀土铕配合物颗粒悬浮的PBS溶液中,30℃下于 震荡培养箱中反应5h,反应完成后离心洗涤;再分散于2mL PBS缓冲液中备用; C、提取大肠埃希氏菌DNA D、杂交 (1)在杂交反应前,将提取的大肠埃希氏菌基因组DNA通过高温解链使其变性成为单 链; (2)将标记上稀土铕配合物的识别探针DNA2与提取的待测单链DNA在固定了DNA1的玻片 上杂交10h;杂交体系为:10μL提取的变性单链DNA溶液,10μL标记了稀土铕配合物的 DNA2溶液,10μL12×SSC溶液;保持杂交温度为43℃; (3)杂交后,将玻片依次在以下三种洗涤液中清洗,洗涤液I 1×SSC/0.03%SDS、洗 液II 0.2×SSC和洗液III 0.05×SSC,洗涤时间均为2min,洗涤温度为43℃; E、杂交后信号检测 杂交清洗后带有稀土铕配合物标记的识别DNA2、捕获DNA1和提取的待测单链DNA探针形 成的杂交体,在激光激发下产生一个光信号,检测出玻片上的稀土长寿命发光配合物的光信 号,激发和发射狭缝分别为8.0nm,延迟时间0.1ms,门时间1.0ms;根据检测的光信号检测 样品中是否存在大肠埃希氏菌DNA。
公开号  101665838
公开日  2010-03-10
专利代理机构  长沙市融智专利事务所
代理人  颜勇
颁证日  
优先权  
国际申请  
国际公布  
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