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HPP1基因甲基化定量检测方法
无权-驳回

申请号:200910196148.6 申请日:2009-09-23
摘要:本发明属于生物医学技术领域。基因的异常甲基化参与肿瘤的发生发展,本发明的目的在于克服甲基化敏感性限制性内切酶法、重亚硫酸盐测序法和甲基化特异性PCR法的缺点,提供一种操作简便、敏感性高的HPP1基因甲基化定量检测方法。本发明取胰腺癌组织,提取DNA制备ACTB的标准曲线样品,利用全甲基化模板,制备HPP1的标准曲线样品;提取待测组织DNA,并进行化学修饰,针对人HPP1基因启动子区CPG岛设计甲基化引物及探针,针对人参照基因ACTB启动子区CPG岛设计BSP引物及探针,采用TAQMAN-MGB实时定量PCR方法对亚硫酸盐处理后的DNA进行实时定量PCR,计算出HPP1基因甲基化程度的定量值。本发明方法快速、准确、灵敏度高。
申请人: 中国人民解放军第二军医大学
地址: 200433上海市翔殷路800号
发明(设计)人: 李兆申 王小玮 高军 杜奕奇 龚燕芳
主分类号: C12Q1/68(2006.01)I
分类号: C12Q1/68(2006.01)I G01N21/64(2006.01)I
  • 法律状态
2012-06-20  发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):C12Q 1/68公开日:20100310
2010-04-28  实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20090923
2010-03-10  公开
注:本法律状态信息仅供参考,即时准确的法律状态信息须到国家知识产权局办理专利登记簿副本。
  • 其他信息
主权项  1、一种HPP1基因甲基化定量检测方法,其特征在于该方法包括如下步骤: A、待检样本处理:用QIAGEN EpiTect Bisufite KitTM试剂盒对待检样本 的DNA进行重亚硫酸盐处理,用作扩增模板; B、分别制备ACTB参照基因的标准品和HPP1靶基因的标准品: 设计并合成ACTB参照基因的BSP引物: ACTB BF:5′TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT 3′ ACTB BR:5′AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA 3′ 设计并合成HPP1靶基因的MSP引物: HPP 1BF:5′AGTAGTAGTAGGGTAGAGAGGGG′3′ HPP 1BR:5′AACCTTAAAATTACACRCTCTT 3′ ACTB参照基因进行BSP反应的条件:95℃预变性10min;95℃变性 30s.60℃退火30s.72℃延伸30s,共40个循环; HPP1靶基因进行BSP反应的条件:95℃预变性10min;95℃变性 30s.53.3℃退火30s.72℃延伸30s,共40个循环; PCR产物进行纯化,连接入pMD18-T Vector,然后电击法转化至E.coli DH5α、工程菌,测序正确的重组菌进行扩增,应用试剂盒抽提纯化质粒, 分别制备出ACTB参照基因的标准品和HPP1靶基因的标准品; C、在BSP扩增片段内设计MSP引物及探针 HHP 1MF:5’GTTGTTTTTAGGTCGGTAAGAGC 3’ HHP 1MR:5’ACGTCCTACTAACGACCGACG 3’ D、HPP1基因甲基化的定量检测: 设计并合成ACTB的探针和HPP1的探针: ACTB探针:FAM-TTTGTTATTGTGTGTTGGGTG-MGB HPP 1探针:FAM-TTAGAGAAAYGTTTTTGGTTT-MGB 对重亚硫酸盐处理过的待检样本DNA,分别同时进行实时荧光定量 PCR、条件是:①95℃10min②95℃15s,70℃15s,60℃1min,共50个循 环;检测ACTB和HPP1基因的拷贝数;待检样本DNA中HPP1基因的拷 贝数除以ACTB基因的拷贝数,即为待检样本中HPP1基因甲基化程度的定 量值。
公开号  101665835
公开日  2010-03-10
专利代理机构  上海德昭知识产权代理有限公司
代理人  丁振英
颁证日  
优先权  
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